上海秉越电子仪器有限公司

产品采集（jí）与样品处理

于同一批 号的 二个运输包装中至少抽取 12个蕞小销售包装样品，1/4样品用（yòng）于检测，1/4样品用于（yú）留样，另（lìng） 1/2样品（可就地封存）必要时用于复检。抽样的蕞小销（xiāo）售包（bāo）装（zhuāng）不应有破裂，检验前不得启（qǐ）开。

在100级净化条件下（xià）用无菌方法打开（kāi）用于检（jiǎn）测的至少 3个包装，从每个（gè）包装（zhuāng）中取样，准确称取10g±1g样品。剪碎（suì）后加人到200ml灭（miè）菌生理盐水中（zhōng），充分混匀，得到一个生理盐水（shuǐ）样液（yè）。液体产（chǎn）品用原液直接（jiē）做样液。

如被检样品含有大量吸水树脂材料而导（dǎo）致不能吸出足够样液（yè）时，稀释液量可按每次 50ml递增，直至能吸出足够测试用样液。在计算（suàn）细（xì）菌菌（jun1）落总数与真菌菌落总数（shù）时相应调整稀释度。

B2  细菌（jun1）菌落总数（shù）与初始污染菌检测（cè）方法（fǎ）

本方法适用（yòng）于产品初始污染菌与细菌（jun1）菌落总数（以下统称为细菌菌落总数）检测。

B2.1 操作（zuò）步骤

待上述生理盐（yán）水样液自然（rán）沉降后取上清液作菌落计数。共接种 5个平皿，每个平皿（mǐn）中加人 1ml样液，然后用（yòng）冷却至45℃左右的（de）熔化的营养琼脂培养基 15～20ml倒人每个平皿内混合均匀 。待琼脂凝（níng）固后翻转平皿置 35℃±2℃培养 48h后，计算平板上的菌（jun1）落（luò）数。

B2.2 结果报（bào）告

菌落呈片状生长的平板不宜采（cǎi）用；计数符合要求的平（píng）板上的菌落，按（àn）式（B1）计（jì）算结果：

X1=A×（K÷5）

式中X1—–细菌菌落总数 cfu/g或cfu/mL；

A——5块营养琼脂培养（yǎng）基平板上（shàng）的细菌菌落总数；

K——稀释度。

当菌落数在 100以内，按（àn）实有数报告，大于 100时采用二位（wèi）有效数字。

如果样品菌落总数超（chāo）过本标准的规定，按 B2.3进行复检和结果报告。

B2.3 复检方法

将留存的（de）复检（jiǎn）样品依前法复测 2次，2次结果平均值都达到本标准的规定，则判定被检样（yàng）品合格；其中有任何 1次结果平（píng）均值超过本标准规定，则判定被检样品不合格。

B3  大肠菌群检（jiǎn）测方法

B3.1 操作步骤

取样液 5ml接种 50ml，乳糖（táng）胆盐发酵（jiào）管，置 35℃±2℃培（péi）养 24h，如不产酸也不产（chǎn）气，则（zé）报告为大肠菌（jun1）群阴性。

如产酸产气，则划线接种伊红美蓝琼脂平板，置35℃±2℃培养 18～24h，观察（chá）平板上菌落形态。典型的大肠菌落为黑（hēi）紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面（miàn）光（guāng）滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫（zǐ）黑色，不带或（huò）略带金属光泽，或（huò）粉红色，中心较深的菌落。

取疑似菌落 1-2个作革兰氏染色镜检（jiǎn），同时接种乳糖发醉（zuì）管，置 35℃±2℃培养 24h，观察产气情况。

B3.2 结果报告

凡乳糖胆盐发酵骨产酸产气，乳（rǔ）糖发酵（jiào）管产酸产气（qì），在伊红（hóng）美蓝平板上（shàng）有典型大（dà）肠菌落，革兰氏染色为阴性无芽胞杆（gǎn）菌，可（kě）报告被检样品检出（chū）大肠杆菌。

B4  绿脓杆菌检测方法

B4.1 操作步骤

取样液 5ml，加人（rén）到（dào）50ml SCDLP培养液（yè）中（zhōng），充分混匀，置 35℃±2℃培养 18～24h。如有绿脓杆菌生（shēng）长，培养液农面呈现一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。从培养液的薄（báo）菌膜处挑取培（péi）养物，划（huá）线接种十六烷三甲基（jī）溴化胺琼脂平板（bǎn），置 35℃±2℃ 培养 18～24h，观察菌落特征。绿（lǜ）脓杆菌在此培养基上生长良好（hǎo），菌落扁平（píng），边缘（yuán）不整，菌落周（zhōu）围培养基略带粉红色，其他菌不长。

取（qǔ）可疑菌落涂片（piàn）作革兰氏染（rǎn）色，镜检为（wéi）革（gé）兰氏阴性菌者应进行下列试验：

氧化酶试验：取一（yī）小块洁净的白色滤（lǜ）纸片放在灭菌平（píng）皿内，用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在滤（lǜ）纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的 1%二甲基对苯二胺试液，30s内出现粉红色或紫红色，为氧化（huà）酶试验阳性（xìng），不变色者为阴（yīn）性。

绿脓菌素（sù）试验：取2-3个可疑菌落，分别接种在绿脓菌素测定用培养基斜面，35℃±2℃培养24h，加入 3～5ml，充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解，待三-氯-甲-烷呈（chéng）蓝色时，用吸管移到另一试管中并加人 1mol/L的盐酸1mL，振荡后静置片刻。如上层出现粉红色或紫红色即为阳性，表示有绿脓菌素存（cún）在。

硝（xiāo）酸盐还原产（chǎn）气试验：挑取被检菌落纯培养物（wù）接（jiē）种（zhǒng）在硝酸盐脉水培养基中，置 35C12C培养24h培养基（jī）小倒管中有（yǒu）气者即为阳性

明胶液化试验:取可疑菌落（luò）纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置 35℃±2℃培养 24h，取出放于4～10C，如仍呈液态为阳性，凝固者为阴性。

42℃生长试验：取可（kě）疑培养（yǎng）物，接种（zhǒng）在普通琼脂斜面培养基上，置 42℃培养 24～48h，有绿（lǜ）脓杆菌生（shēng）长（zhǎng）为（wéi）阳性。

B4.2 结果报告

被检样品经增菌分离培养后，证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓杆菌试验（yàn）均为阳性者（zhě），即可报告被检样品中检出绿脓杆（gǎn）菌 如绿脓菌素试验阴性而液化明（míng）胶、硝酸盐还原产气和42℃生长（zhǎng）试验三（sān）者皆（jiē）为阳性时，仍可报告被检样（yàng）品中检出绿脓杆（gǎn）菌。

B5 金（jīn）黄（huáng）色葡萄球菌检测方（fāng）法

B5.1 操（cāo）作步骤

取（qǔ）样液 5ml，加入到 50mL SCDLP培（péi）养液中，充分混（hún）匀，置 35℃±2℃培养 24h，自上述增菌液中取1～2接种环，划线接（jiē）种在血琼脂培养（yǎng）基上，置 35℃±2℃培（péi）养24～48h。在血琼脂平（píng）板上该菌菌（jun1）落呈金黄色，大而突起（qǐ），圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。

挑（tiāo）取典型菌落（luò），涂片作革兰氏染色镜检，金黄色（sè）葡萄球菌为（wéi）革兰氏阳性球菌，排列成葡萄状，无芽（yá）胞与（yǔ）荚膜。镜检符合 上述情况，应进行下列试验：

甘露醇发酵试验：取上述菌落接种甘露醇培养液，置 35℃±2℃培养 24h，发酵甘露醇（chún）产酸者为（wéi）阳性。

血浆凝固酶试验：（1）玻片法：取清洁干（gàn）燥载玻片，一端滴加一滴生理盐（yán）水，另一端滴加一滴兔血浆，挑:取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5min如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴（dī）仍呈均匀混浊无凝固则为阳性，如两者（zhě）均无（wú）凝固（gù）则（zé）为阴性。凡盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再（zài）进行试管凝固酶试验；（2）试管法：吸取 1：4新鲜血浆 0.5ml，放灭菌小试管中，加入等量待（dài）检菌 24h肉汤培养物 0.55mL，混匀，放 35℃±2℃温箱或水浴（yù）中，每半（bàn）小时观察（chá）一次（cì），24h之内呈现凝块即为阳（yáng）性。同时以（yǐ）已知血浆凝（níng）固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物各0.5ml，作为阳性与阴性对照。

B5.2 结果报告

凡在琼脂平板上有可疑菌落生长（zhǎng），镜检（jiǎn）为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露（lù）醇产酸，血浆凝固酶试验阳（yáng）性者（zhě），可报告被检样品检出金黄（huáng）色葡萄球菌。

B6 溶血性链球菌检测方法

B6.1 操作步骤

取（qǔ）样液（yè） 5ml加人到 50ml葡萄糖肉汤， 35℃±2℃培养 24h，将培养物划线接种血琼脂平板， 35℃±2℃培养24h观察菌落特征。溶血性链球（qiú）菌在血（xuè）平板上为灰（huī）自色，半透明或不透明，针尖状突起，表面光滑，边（biān）缘整齐，周（zhōu）围有无色透明溶血（xuè）圈。

挑取典型（xíng）菌落作涂片革兰（lán）氏染色镜检，应为革（gé）兰（lán）氏阳性，呈链状排列的球菌。镜检符合上述情（qíng）况，应进行下（xià）列试验：

链激酶试验：吸取草酸钾血浆 0.2ml（0.01g草酸（suān）钾（jiǎ）加5mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸（xī）取上清液），加人 0.8ml灭菌生理盐水，混匀后再加人待检菌 24h肉汤培养物0.5ml和0.25%氯化钙0.25ml，混匀，放（fàng） 35℃±2℃水（shuǐ）浴中，2min观察一次（一般10min内可凝固），待（dài）血浆凝固后继续观察并记录溶化时（shí）间。如 2h内不溶化，继续放置 24h观察，如凝块全部（bù）溶化为阳性，24h仍不溶化为阴性。

杆菌肤敏感试验：将被检菌（jun1）菌液涂（tú）于血平板上，用灭菌镊子取每（měi）片含 0.04单位（wèi）杆菌肤的纸片（piàn）放（fàng）在平板表面仁，同时以已知（zhī）阳性菌株作对照，在 35℃±2℃下放置 18～24h，有抑菌带者为阳性。

B6.2 结果（guǒ）报告

镜检革兰氏阳性（xìng）链状排列球菌，血平板上呈现溶血（xuè）圈，链激（jī）酶和杆菌肤（fū）试验（yàn）阳性，可报告被检样品检出溶血性链球菌。

B7 真菌菌（jun1）落总数检（jiǎn）测方法

B7.1 操作步骤

待上述生（shēng）理盐水样液自然沉降后取（qǔ）上（shàng）清液作真菌计数。共接种5个平皿（mǐn），每个平皿中加人（rén） 1ml样液，然后用冷却至 45℃左右（yòu）的熔化的沙氏琼脂培养（yǎng）基 15 ～25mL倒人每个平皿内混合均匀，琼脂凝固后翻转平皿置 25℃±2℃培（péi）养 7天，分别（bié）于 3，5，7天观察，计算平板上的菌落数，如果发现（xiàn）菌落蔓延，以前 一（yī）次的（de）菌落计数为准。

B7.2 结果报（bào）告

菌落呈片状（zhuàng）生长的平板（bǎn）不宜采（cǎi）用（yòng）；计（jì）数符合要求的平板上的菌落，按式（B2）计算结（jié）果：

X2=B×（K÷5）

式中X2—–真菌菌落总数，cfu/g或cfu/mL；

B—–5块沙氏琼脂（zhī）培养基平板上的真菌菌落总数;

K—–稀释度。

当菌（jun1）落数在 100以内，按实有数报告，大于 100时采用二位有效数（shù）字。

如果样品菌落总数超过本标准的规定，按 B7.3进行复检和结果报告。

B7.3 复检方法

将留（liú）存的复检样品依前法复测 2次，2次结果都达到（dào）本标准（zhǔn）的规定，则判（pàn）定被检样品合格；其中（zhōng）有任何 1次结果超过本标准规定，则判定被检样品不合格（gé）。

B8 真菌定性检测方法

B8.1 操作步骤

取样液 5mL加入到50mL沙（shā）氏培养基（jī）中， 25℃±2℃培养 7天，逐日观察有无真菌生长。 

B8.2 结果报告

培养管混浊应转种沙氏琼脂培养基，证实有真菌生长，可报告被检样品检出真菌。