上海秉（bǐng）越電子儀器有限公司

OOS(outofspecification,超限度、超規格)結果，是指產品質量指標測試中超出已經建立的可接受標準的單個或（huò）一係列結果。無菌產品的陽性結果（guǒ）、微生物限度試驗超出行動值或超過規格、內毒素試驗結果超標準等均為OOS結果《中國藥典》2015年（nián）版m和新版《藥品（pǐn）生產質量管理規（guī）範》（GMP)增加了OOS調查章節，對微生物實驗室00S結果的調查做出了較為詳細的闡述和（hé）實例分析（xī），要求任何OOS結果必須按照書麵規（guī）程進行完整的調查。因（yīn）為隻有（yǒu）確定了（le）OOS結果（guǒ）產生的原因並判定其是否有效，進而才能製訂完善的預防和整改措施，以保證檢（jiǎn）驗結果的準確性。因此，實驗室（shì）建立OOS調查（chá）處理程序，對OOS結果進行科學（xué）、及時、有效（xiào）的調查分析處理是十分必要的微生物在（zài）自然環境中無處不在，並可能會隨（suí）檢驗人（rén）員、檢驗用器材以及檢品的包裝容器進入檢驗環境。因此，關於微生物檢（jiǎn）驗中藥品的無菌檢査項目，新版藥典對其操作環境提出了更高要（yào）求，新版GMP也加強了對無菌操作環境空氣微生物、表麵微生物以及人員手套和（hé）操作服表（biǎo）麵微生物（wù）的監測頻率，並做出了明確（què）規定。而對於無菌檢（jiǎn）査OOS結（jié）果的調査（chá），需核實的相關（guān）記錄和影響因素更為繁雜。基於它的複雜性，OOS結果的調查須追溯到（dào）實驗過程（chéng）的每（měi）一個環（huán）節（jiē），而對於它的變異（yì）性，調查過程又需針對不同的OOS結果著重分析調查相應的不（bú）同環節。
對於微生物實驗室OOS的調（diào）查，局（jú）限於每個檢驗單位的技術水（shuǐ）平和資源（yuán），同樣限於人類對微生物掌握的局限，不是每次的OOS調（diào）査都（dōu）可以（yǐ）發現其根本原因，但通（tōng）過（guò）此調査（chá）過程仍能夠幫助調查者找出超標結果發生的可能原因並進而采取糾正預防措施，基（jī）於風險分析，對相關批次產品做出最後處理決定'從而降（jiàng）低藥品質量風險（xiǎn），既是保證藥品質量的重要工作，又是質量體係持（chí）續改進的（de）原動（dòng）力。本文通過對4批無菌產品的（de）無菌檢査（chá）實驗全過程的回顧性分析和調查，探索導致無菌實驗OOS結果的明確原因，以期建立微生物實驗室完善的OOS調査方（fāng）案。
1、材料、儀器與（yǔ）試劑
全自動智能無菌集菌（jun1）儀(上海秉越zw-2008)一（yī）次性使用全封閉集菌培養器（qì）顯微鏡AxiosescopeA
全自動（dòng）微生物鑒定儀（yí）
酵（jiào）母菌鑒定卡
無菌檢查樣品為4個批號的注射用頭孢噻膀（bǎng）鈉。
2、方法與結果
2.1實驗方法（fǎ）
 
2.1.1藥品的無菌檢查
依照《中國藥典》2010年版（bǎn）_檢驗（yàn）注射用頭孢噻肟鈉（nà）的無菌檢（jiǎn）查項目。
2.1.2鏡檢及鑒定
取陽性樣本，劃（huá）線TSA平板培養24~48h，按照儀器及試（shì）劑的使用說明，對經過純化的微生物進行革蘭（lán）氏（shì）染色，確定微生物（wù）形（xíng）態，然後根據形態選擇鑒定卡，使用全自動微生物鑒定儀Vitek2Compact進行鑒定。
 
2.2結果
 
4個（gè）批號的注射用頭孢噻肟鈉的無菌檢（jiǎn）查檢驗結（jié）果如表1所（suǒ）示：2號和4號（hào）樣品改良馬丁培（péi）養（yǎng）基均在第3天變渾濁。取改良馬丁培養液劃線TSA平板，30~35℃培養48h，平板（bǎn）上（shàng）呈現白（bái）色、光滑、邊緣整齊（qí）、形態單一的菌落。
革蘭氏染色鏡檢結果為酵母菌。經全自動微生物鑒定儀Vitek2Compact鑒定，均為季也蒙假（jiǎ）絲酵母。
 
3、OOS結果的調查和分析
依據新版GMP對OOS調查的要求，回（huí）顧性分析調查注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查OOS結果產生的（de）原因（yīn）。
 
①日常監控和驗收記錄：
培養基（jī）的驗收記錄、培養基的製備和滅菌記錄、檢驗器具準備和滅菌記錄、消毒液配（pèi）置和（hé）無菌過（guò）濾記錄、潔淨室清潔（jié）消毒記錄（lù）、檢驗員使（shǐ）用潔淨服的滅菌（jun1）記錄和使用記錄、無（wú）菌檢（jiǎn）驗操作記錄以及環境監控記錄等均未發現異常。
②人員：
甲和乙實驗人員（yuán）均能熟練掌握無菌檢驗的流程、監（jiān）控要點和無（wú）菌操作（zuò）規（guī）範。
③樣品：
確認樣品的編號和批號無誤，無菌檢査取樣前（qián），樣品西林瓶外觀正常，西（xī）林瓶蓋並未發現鬆動的跡象。
④實驗器具（jù）：
實驗中使用的py330集菌器、一次件使用無菌注射器以（yǐ）及（jí）一次性使用無菌手套的無菌驗收均符合（hé）規定，且用於當天其他檢品的檢驗，並未（wèi）發現汙染情況。
⑤培養（yǎng）基（jī）及衝洗液和稀釋液：
無菌檢查用培養基的陰性對照均符合規定，且同批製備和滅菌的培養基用於同日檢查的其他（tā）檢品，並未發現汙染情況。
⑥檢驗環境：
現場環境監控的3皿沉降菌監測的TSA平皿均（jun1）未有菌落生（shēng）長，並未出現汙染情況。定期環境檢測（cè）表麵（miàn）菌符合規定，樣品無菌（jun1）檢查當日潔淨空（kōng）調係統均運行（háng）正常。
⑦不同檢驗體係對結果判定造成的影響：
由於現行《中國藥典》無菌（jun1）檢查（chá）使（shǐ）用的改良馬丁培養基不同於國（guó）際標準使（shǐ）用的TSB,將改（gǎi）良馬丁培養物劃線TSA平板上長出（chū）的菌落接種至TSB培養液中in),24h後（hòu）培養液即出現混濁現象。因此可以排除因檢驗體係不同造成的實驗結（jié）果偏差。
⑧菌株：
樣品檢出（chū）菌經鑒定為季也蒙假絲（sī）酵（jiào）母菌（jun1），比對曰常潔淨室監控收集的菌株建立的菌庫，潔淨室中從未監測到（dào）此種菌株。
⑨附加實驗的結果與分析：
通過以上分析（xī），初步認定無菌不合格為實驗有效結（jié）果。但鑒於此次無（wú）菌檢驗過程並未嚴格按照新版GMP和（hé）《中國藥典》2015年版（bǎn）規（guī）定的（de）對檢（jiǎn）驗環境和人員的全麵監（jiān）控，環境（jìng）和人員帶來的汙染（rǎn）仍有造成OOS結果的可能性，附加實驗就是對（duì）檢驗環境進行全麵監測。
現場環（huán）境監控按照（zhào）新版GMP的要求實施，並增加對潔淨室回風口浮遊菌的監（jiān）測，監測結果均符合（hé）規定。微生物監測方麵，除實驗人員（yuán）無菌服胸口處采集到一個菌落，其（qí）他均未有（yǒu）菌落生長。實驗人員無菌服采（cǎi）集到的菌落為革蘭氏陽性球菌，經鑒定為Kocuriakristinae(克氏庫克菌），此菌種曾在日常潔淨室（shì）監控中不止一次檢出過，並未對樣（yàng）品產生（shēng）過汙染。
4、結論與討論
OOS結果表明，並未在實（shí）驗室發現導致OOS結果的（de）明確原因，檢出菌也並非由於實驗室（shì）檢驗過程帶（dài）來（lái）的汙染（rǎn），懷疑樣品本身被季也蒙假（jiǎ）絲酵母菌所（suǒ）汙（wū）染（rǎn），從而導致無菌檢查的陽性結果。
通過對（duì）上述OOS的調查和（hé）分析，初步建立了微生物實驗室OOS結果調查的分析方案，分別從人、機（jī）、料、法（fǎ）、環5個方麵進行闡述：
人——實（shí）驗人員（yuán）。考察人員（yuán）是否經過相關檢驗的（de）培訓和考核，是否了解該項檢驗的流程和監控要點。無菌區全體人員（yuán）每年應進行一次再培訓和資格的再確認，對無菌區人（rén）員操作服和手套表麵的微生物監測嚴格按新版GMP執行；
機——實驗中使（shǐ）用的儀器設備。檢查集菌儀等（děng）儀器近期使（shǐ）用記錄是否發現異常，參數設置是否（fǒu）正確。儀器的計量和校準均需在有效期內，無（wú）菌區內（nèi）使用的儀器需定期消（xiāo）毒（dú）並定期進行微（wēi）生物的（de）表麵監（jiān）測，使用的器具需經滅菌消毒，一次性使用器具需經質量驗收；
料——樣品、培養基、稀釋液和衝洗液。檢查剩餘樣品的編號和批號是否準確，樣品（pǐn）的外觀是否異常，瓶蓋是否有鬆脫現象以及（jí）樣品（pǐn）的前期存放條件和取樣方式是（shì）否合理。必（bì）要時，對樣品的瓶蓋和瓶口等（děng）關鍵部位擦抹取樣，培養觀察；
檢查培（péi）養基質量驗收記錄和配製記（jì）錄，確認配製和滅菌是否合（hé）理有效，是否用於其他樣品的檢驗，培養基、稀釋液和衝洗液的陰性對照應符合規定；
法——檢驗方法和依據。實驗所用標準應符合設定實驗和檢驗依據的要求；
環——實驗環（huán）境。檢查潔淨（jìng）空調係統是否運（yùn）行正常，監（jiān）測記錄包括（kuò）定期監控記錄和實驗現場環境監控記（jì）錄，是否（fǒu）符合潔淨度要求，清潔記錄顯示是（shì）否按時清潔，消毒液是否（fǒu）使用合理。另外，未確定OOS結果產生的明確原因時，不能（néng）急於（yú）對環（huán）境進行消（xiāo）毒（dú）處理，以免忽略（luè）了可能的（de）環境汙染因素。
 
微生物負荷和實驗檢出菌（jun1）的比對分析。實（shí）驗室的微（wēi）生（shēng）物（wù）負荷，包括潔淨室的空氣微生物、表麵微生物和人員操作服及手套（tào）的表麵微生（shēng）物。對（duì）日常環境監控收集的菌株進行有（yǒu）效鑒別和分析，建立潔淨室生（shēng）物負載數據庫，可（kě）為（wéi）微生物（wù）OOS調査提供（gòng）數據基礎。
 
對檢出菌進行鑒定，分析監控收集的（de）微生物分布（bù）和鑒定與陽性結果的相關性，當發現與陽性菌株相近的菌株時，可利用分子生物學方（fāng）法比對陽性（xìng）菌株與微生物負荷的同源（yuán）性，為（wéi）陽性菌的（de）汙染溯源提供依據。
此外，對不同實驗會產生不同的OOS結果，可針對某些相關環節靈活（huó）考察（chá）。例如，針對（duì）不同的微（wēi）生（shēng）物，采用不同的監測手段，陽性檢出（chū）菌為酵母菌時，增加沙氏葡萄糖瓊（qióng）脂用於環境監控的附加實驗，則能夠更好地確認環境中的該類微生物。
需要著（zhe）重強調的是，檢出菌的鑒別對於OOS結果的調查非常關鍵，決定最後是否可（kě）以發現根本原因，應該給予足（zú）夠重視。
綜上所述，微生物相關檢驗項目OOS結果的調查（chá）工作量很大，且專業（yè）性強，實驗室不僅需要具備（bèi）受過（guò）良好培訓和具有豐富檢驗經驗的工作人（rén）員，還需建（jiàn）立完（wán）善的OOS調查方案來規範調查操作。